NK細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作方案  

(2L體系版本)

【溫馨提示】

為了能獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，請(qǐng)嚴(yán)格按照以下所述步驟進(jìn)行操作，并使用我們推薦的實(shí)驗(yàn)耗材及試劑。本試劑盒包含四種刺激組分(NK Cell Grower1~4)，每管體積為1ml，建議每管組分拿出靜置后再加入到培養(yǎng)基中，并用培養(yǎng)基潤(rùn)洗管子，以確保每管所有組分都能加入到培養(yǎng)基中。請(qǐng)認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)配置每種擴(kuò)增液！

【實(shí)驗(yàn)材料】

NK Cell Culture Medium(1000 ml) X 2

NK Cell Grower 1(1 ml)  NK Cell Grower 2(1 ml)  

NK Cell Grower 3(1 ml)  NK Cell Grower 4(1 ml)

懸浮細(xì)胞專(zhuān)用細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T75、T175)(透氣蓋培養(yǎng)瓶，推薦康寧品牌)

懸浮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)袋

淋巴細(xì)胞分離液

無(wú)菌生理鹽水或PBS

【實(shí)驗(yàn)操作方案】

* 所有的工作必須在無(wú)菌室中進(jìn)行，請(qǐng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，使用無(wú)菌耗材。

1、培養(yǎng)瓶包被

(1)  在T-75 cm² 懸浮培養(yǎng)瓶中，加入8 ml PBS 和1ml NK Cell Grower 1；

(2)  輕輕搖晃，使溶液在培養(yǎng)瓶瓶底擴(kuò)散，鋪滿瓶底；

(3)  37℃培養(yǎng)箱靜置2 h 或在4℃靜置過(guò)夜；

(4)  移除包被溶液，用15 ml PBS 潤(rùn)洗瓶底1 次(請(qǐng)勿吹打瓶底)，洗過(guò)的培養(yǎng)瓶要立即使用。

2、血液分離

(1) 采集40 ml外周血于抗凝管(務(wù)必用肝素抗凝管)，800g，15 min室溫離心；

(2) 自體血漿制備：取上清血漿，置于水浴鍋中56℃，滅活30 min后 1100g，15 min室溫離心，用移液管將上清轉(zhuǎn)移至新的15ml管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆茫?/span>

（3）取上述離心后下部細(xì)胞成分，加PBS至40 ml，混勻，加到2個(gè)裝有2ml醫(yī)療級(jí)人淋巴細(xì)胞分離液的5ml離心管中，室溫下， 500g 離心30 min，慢升慢降(加速度2，減速度0)； 

（4）離心后，血液被分為4 層，由血漿(上層)、血漿和分離液之間的單個(gè)核細(xì)胞(第

2 層)、分離液(第3 層)和紅細(xì)胞層(底層)構(gòu)成。

3、制備PBMC

（1）用吸管將第2 層單個(gè)核細(xì)胞收集至新的離心管；

（2）加入40 ml PBS洗滌細(xì)胞懸液，300g 離心8 min；

（3）棄去上清液，再加入40 ml PBS洗滌細(xì)胞懸液，300g 離心8 min。

（4）棄去上清液，加入20 ml NK Cell Culture Medium稀釋細(xì)胞懸液，混勻，取100 μl 懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)，余下懸液300g 離心 8 min。

注：整套試劑可激活4-6*10⁷PBMC，多余細(xì)胞可以棄去。

4、NK 細(xì)胞擴(kuò)增

(1)  Day0，配置NK細(xì)胞擴(kuò)增液A：將全部的NK Cell Grower 2加入到25 ml NK Cell Culture Medium 中，同時(shí)加入2.5 ml滅活后的自體血漿。用該擴(kuò)增液重懸將上述細(xì)胞到2~2.5*10⁶/ml(根據(jù)收獲的PBMC細(xì)胞數(shù)來(lái)決定重懸密度, 確保重懸密度在該范圍內(nèi), 有利于NK細(xì)胞激活)；

（2）在已包被的T75培養(yǎng)瓶中，加入以上細(xì)胞懸浮液(以20~25ml最合適)，請(qǐng)沿培養(yǎng)瓶側(cè)壁加入細(xì)胞，動(dòng)作需輕柔，請(qǐng)勿直接吹打培養(yǎng)瓶底；

(3）5% CO2、37℃培養(yǎng)3天(在此期間請(qǐng)勿移動(dòng)細(xì)胞，整個(gè)培養(yǎng)以靜置為主)；

(4)  Day3，配置NK細(xì)胞擴(kuò)增液B：將全部的NK Cell Grower 3加入到460 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管輕輕吹打T75培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入40 ml NK細(xì)胞擴(kuò)增液B(剩余擴(kuò)增液B放2-8℃保存)，同時(shí)補(bǔ)加4 ml滅活后的自體血漿；

(5)  Day5，用移液管輕輕吹打細(xì)胞，取細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，加入約80 ml NK細(xì)胞擴(kuò)增液B于T175培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，同時(shí)補(bǔ)加4 ml滅活后的自體血漿，使細(xì)胞密度保持在1*10⁶/ml左右；

(6)  Day7，用移液管輕輕吹打細(xì)胞，將細(xì)胞懸液平均轉(zhuǎn)入兩個(gè)培養(yǎng)袋內(nèi)，加入剩余的NK細(xì)胞擴(kuò)增液B和剩余的滅活自體血漿（每個(gè)培養(yǎng)袋等量加入）；

(7)  Day9，配置NK細(xì)胞擴(kuò)增液C：將全部的NK Cell Grower 4加入到剩余的1500 ml NK Cell Culture Medium 中。視細(xì)胞生長(zhǎng)密度，每個(gè)培養(yǎng)袋補(bǔ)加350-450 ml NK細(xì)胞擴(kuò)增液C（使補(bǔ)液后細(xì)胞密度保持在0.8*10⁶/ml左右）(剩余擴(kuò)增液C放2-8℃保存)；

(8)  Day11，向每個(gè)培養(yǎng)袋內(nèi)補(bǔ)加等量剩余的NK細(xì)胞擴(kuò)增液C；

(9)  Day14，鑒定細(xì)胞，同時(shí)取樣檢測(cè)真菌、細(xì)菌、支原體、內(nèi)毒素等指標(biāo)。

所有培養(yǎng)液使用前需先預(yù)溫，用多少預(yù)溫多少, 避免反復(fù)預(yù)溫對(duì)細(xì)胞因子活性的影響！

5、細(xì)胞收集

（1）經(jīng)過(guò)14 天的培養(yǎng)，將細(xì)胞懸浮液從培養(yǎng)袋，轉(zhuǎn)入大型的離心瓶，用離心機(jī)以600g 離心10 min，分離細(xì)胞和培養(yǎng)基；

（2）小心地移去上清液，用含有0.1%人類(lèi)血清白蛋白的生理鹽水(0.1%HSA 生理鹽

水)，懸浮所有的細(xì)胞沉淀物，收集到一個(gè)離心瓶中。重復(fù)離心，清洗細(xì)胞3 次；

（3）收集細(xì)胞，用適量含有1%人類(lèi)血清白蛋白的生理鹽水重懸細(xì)胞，通過(guò)一次性

細(xì)胞篩(200目)過(guò)濾，收集并注入含有1%人類(lèi)血清白蛋白的生理鹽水回輸液中，總量為100~200 ml。封裝好后送病房，同時(shí)留樣封存以備日后檢測(cè)。

附錄  操作流程表：